Criblage PCR S aureus

TD 6 : Design d’amorces en vue d’un diagnostic PCR de staphylococcus aureus

Retrouver la séquence d’un gène spécifique de Staphylococcus aureus pour le diagnostic pathologique.
Choisir deux amorces permettant d’amplifier une portion de gène désirée afin de vérifier la présence du germe pathogène.
S'initier à la comparaison de séquence.

Staphylococcus aureus est un germe responsable d’infections graves telles que l’endocardite, l’ostéomyélite…

Le diagnostic peut être établi si le germe est isolé mais l’identification reste longue.

La PCR constitue une technique spécifique, rapide et reproductible.

I- Recherche du gène à amplifier

Sur le site du NCBI, dans la base de données "GENE", rechercher la fiche correspondant à la séquence du gène de la thermocucléase de S. aureus ED98 "thermocuclease Staphylococcus aureus ED98".
Cliquer sur le lien : " See also 2 discontinued or replaced items".
Repérer le numéro d'accession du génome (NC_013450.1) et cliquer sur le lien (cela renvoie vers la fiche au format GenBank).
Noter la taille de la séquence du gène.
Copier et enregistrer la séquence du gène au format brut et au format Fasta dans votre document Word.

II- Utilisation d’amorces spécifiques

D'après la séquence des amorces, identifier leur position sur la séquence au format brut à l'aide d'une flèche correctement orientée, et préciser l'orientation 5'-3'.
Déterminer la taille de l'amplicon

Rappel :

Par convention :

Le primer FORWARD (FWD – pour sens) a une séquence identique au brin codant (5’-3’)

Le primer, REVERSE (REV- antisens) a une séquence complémentaire au brin codant

III- Vérification de la position des amorces

Calculer la Tm en °C pour chaque amorce nucF et nucR à l’aide de la relation suivante (formule de WALLACE) :

Tm = 2x(A+T) + 4x(G+C)

A l’aide du logiciel Primer3 (lien inclu) :

Copier la séquence au format FASTA dans l’encart prévu à cet effet.
Copier les amorces FWD et REV dans les encarts correspondants. Attention, les espaces à l'intérieur et aux extrémités des séquences doivent être supprimés.
Cliquer sur « pick primers »

• Relever la taille de l'amplicon, la Tm, et les autres informations utiles.

• Consigner les résultats dans le document word.

A l'aide du logiciel Primer-Blast (lien inclu) du NCBI

Dans "PCR template" : copier la séquence au format fasta dans l’encart prévu à cet effet.
Dans "Primer parameters" : copier les amorces FWD et REV dans les encarts correspondants. Attention, les espaces à l'intérieur et aux extrémités des séquences doivent être supprimés.

3. Dans "Primer Pair Specificity Checking Parameters" :

Database : sélectionner nr

Organism : sélectionner Staphylococcus aureus (taxid:1280)

Relever la taille de l'amplicon, la Tm, et les autres informations utiles.
Parcourir l'ensemble de la page jusqu'aux derniers résultats présentés : vous devez comprendre ce qui est présenté à chaque fois, notamment la signification des points). rappel : template = matrice)
Expliquer dans votre compte-rendu l'intérêt de cette analyse proposée par ce logiciel.
Comparer les résultats des deux programmes (Primer Blast et Primer 3).

IV- Vérification de la spécificité des amorces

Vérifier la spécificité du diagnostic par PCR en testant la spécificité des primers sur d'autres souches bactériennes.

- Dans "Primer Pair Specificity Checking Parameters » :

- Staphylococcus epidermidis

- Micrococcus luteus

- Thermus thermophilus

- Streptococcus

Database : sélectionner nr

NB : on ne laissera pas S aureus!

- Analyser les résultats et les éventuels amplicons obtenus. Bien lire le début de la page de résultats)

- Conclure sur la qualité des amorces dans le cadre du diagnostic envisagé.

- Consigner les résultats dans votre compte-rendu.