1. RECHERCHE DES FICHIERS PDB DE LA GFP SAUVAGE ET DE LA GFP UV

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A l’aide de l’interface ncbi, dans le menu « protein », rechercher les fichiers *.pdb  des deux gfp et de ses mutants :

1GFL_A : structure of green fluorescent protein
1B9C_A : Structure of gfp-uv

 

Cliquer sur l’image 3D de la molécule à droite de l’écran.
Dans la fenêtre de droite « View or Save 3D Structure » choisir le fichier au format pdb, cliquer sur "View structure" et enregistrer le fichier en veillant à bien nommer la protéine selon son code.

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2. ETUDE DE LA STRUCTURE TRIDIMENTIONNELLE DE LA GFP SAUVAGE.

 

2.1. Ouvrir le fichier correspondant à la séquence de la GFP sauvage à l'aide du logiciel Rasmol.

 

NB : deux fenêtres s'ouvrent à l'ouverture du fichier. L'une permet de visualiser la structure de la molécule, l'autre "Rasmol command Line" permet de taper des lignes de commandes (voir Tutoriel pdf)

2.2. Tester les différentes représentations possibles de la molécule (« Display ») et faire tourner dans l’espace la molécule à chaque nouveau mode, pour analyser les nouvelles informations présentées.
2.3. Conserver le mode qui vous permet la meilleure observation de la structure.
2.4. A l’aide de la fonction « show sequence », tapée dans la fenêtre de commande, déterminer le nom du premier et du dernier Acide aminé de la protéine.
2.5. Faire apparaître sur la molécule dans deux couleurs différentes, le premier et le dernier acide aminé (fonctions « select » et « colour » )
2.6. A l’aide de la fonction « colour » faire apparaître et déterminer le nombre de chaines impliquées dans le cristal.
2.7. A l’aide de la fonction « colour » et « group » déterminer le nombre de feuillets β impliqués.
2.8. Faire apparaître en bleu, les trois acides aminés du chomophore.
2.9. Ces acides aminés sont-ils situés en surface ou à l’intérieur de la molécule ?

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Q1 : Exporter deux images différentes et pertinentes du résultat au format GIF, et décrire en quelques lignes la structure mise en évidence (nombre de protomères, nombre de feuillets, d’hélices, de tours, d’acides aminés, nom de la structure tertiaire, particularité du chromophore….).

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3. ETUDE DE LA STRUCTURE TRIDIMENTIONNELLE DE LA GFP UV

 

3.1. IDENTIFICATION DES 3 ACIDES AMINES MUTES

 

Ouvrir le fichier correspondant à la séquence de la GFP uv, puis: 

 

3.1.1. Retrouver dans les informations liées au fichier (« show info »), les 3 mutations impliquées dans l’augmentation de la fluorescence. 

3.1.2. Taper la fonction "show sequence".

En observant en détail, on peut constater que : 

- Il manque les 3 premiers AA de chaque chaine

- Tous les AA de chaque chaine non sont pas présents dans la liste

- La position des AA mutés, est différente dans la liste par rapport aux informations données dans "show info".

Relever la position des trois acides aminés mutés dans liste et la noter précieusement.
3.1.3. Faire apparaître en une seule couleur le squelette de la molécule (« backbone »)
3.1.4. Faire apparaître les trois acides aminés mutés en jaune, orange et vert. A chaque fois, faire apparaître chaque acide aminé en mode « ball & stick ».

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Q2 : Les 3 acides aminés sont ils proches en structure I, II ou III ?

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3.1.5. Faire apparaître les liaisons hydrogène dans toute la molécule.

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Q3 : Les acides aminés mutés interagissent-ils ensemble via des liaisons hydrogènes ? (aidez vous de la fonction « zoom ».​

Q4 : Les chaines latérales des trois acides aminés sont) elles tournées vers l’intérieur ou l’extérieur de la molécule ?

Q5 : D’une façon générale, les 3 acides aminés sont ils plutôt localisés en surface ou à l’intérieur de la molécule ?

Q6 : Exportez une image (choisir un angle judicieux) montrant ce que vous venez de mettre en évidence, au format GIF. Vous vous en servirez pour illustrer vos réponses aux questions précédentes.

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3.1.6. Confirmez votre analyse grâce à une autre modélisation (« display cartoon »).

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Q7 : Exporter une nouvelle image.

3.2. ETUDE DU CHROMOPHORE

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3.2.1. Faire apparaître en bleu, les trois acides aminés du chomophore.

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Q8 : Ecrire sur votre compte-rendu, les lignes de commandes utilisées.​

Q9 : Les acides aminés du chromophore sont-ils situés en surface ou à l’intérieur de la molécule ?

Q10 : Existe-il des liaisons hydrogène entre ces acides aminés et les 3 acides aminés mutés ?

3.3. COMPARAISON DES DIFFERENTES STRUCTURES 3D

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Q11 : La structure globale de la protéine et du chromophore ont elles changé suite aux trois mutations ?​

Q12 : Peut-on imputer au changement de conformation de la molécule, l’augmentation de la fluorescence ? Autre hypothèse ?