TD2 : élaboration d'une stratégie de sous-clonage
Objectif
On souhaite sous-cloner le gène de la luciférase dans le vecteur de clonage pGEM-3Z.
Le vecteur d'origine, contenant le gène de la luciférase est le plasmide pGEM-luc.
Les cartes des vecteurs ne sont pas disponibles.
On va donc devoir :
- Récupérer les séquences nucléotidiques de chaque plasmide
- Générer une carte simplifiée pour les 2 plasmides
- Identifier des enzymes permettant un sous-clonage directionnel
- Calculer la taille des fragments générés après coupure afin de prévoir l'aspect du gel de contrôle
Prérequis
Connaitre les grandes fonctionnalités du site NCBI
Connaitre les différents formats de séquence
Voir la rubrique "A SAVOIR"
Consignes de rédaction du compte-rendu
Relever les informations et les réponses aux questions posées dans votre compte-rendu.
Inclure les images.
Analysez les résultats.
La qualité de la rédaction et de la présentation sera prise en compte dans la notation.
I - Récupération des séquences nucléotidiques de pGEM-3Z et pGEM-luc
Sur le portail du NCBI, sélectionner la banque de données "NUCLEOTIDE", et rechercher la séquence de pGEM-3Z
- Cliquer sur le lien pertinent. Une page apparaît au format GenBank. Cliquer sur le lien FASTA en dessous du titre pour obtenir la séquence nucléotidique au bon format.
- Copier et coller la totalité de la séquence dans un document word. Enregistrer le document sous le nom CR TD2.
- Suivre la même démarche pour pGEM-luc, à partir d'un nouvel onglet (conserver l'onglet précédent!)
II - Établissement des cartes simplifiées des plasmides et vérification des séquences
Le logiciel PlasMapper permet d'établir des cartes plasmidiques.
NB : il arrive (trop!) souvent, que le serveur de Plasmapper soit en panne!
Si tel est le cas, on utilisera "Analyse Sequence" proposé par Addgene.
Utilisation du logiciel Plasmapper :
- Copier et coller la séquence du plasmide pGEM-3Z dans la fenêtre prévue à cet effet.
- Conserver les paramètres par défaut à l'exception des paramètres suivants :
- Affichage des sites communs et uniques de restriction d'une taille supérieure ou égale à 6 pb
- Taille de l'image générée : 1200* 1000
- Cliquer sur "Graphic Map" pour lancer le programme.
- Enregistrer l'image obtenue au format .png dans votre compte-rendu.
- A l'aide de la fiche au format "GenBank" du NCBI et du résultat de PlasMapper, construire un tableau et :
- Relever la taille du plasmide
- Identifier la nature et la position du gène de sélection (relever les positions des premiers et et derniers nucléotides)
- Déterminer la signification du terme "complement" utilisé pour ce gène sur le rapport "GenBank"
- Relever la position du MCS
- Relever la position du gène lacZ . Comparer ici les résultats des 2 programmes.
Effectuer la même démarche sur Plasmapper avec la séquence de pGEM-luc, et penser à enregistrer l'image obtenue.
- Relever la taille du plasmide
- Retrouver la taille et la position du gène de la luciférase
A partir des deux cartes plasmidiques, identifier 2 enzymes permettant de faire un clonage directionnel
Utilisation du logiciel Analyse Sequence :
- Copier et coller la séquence du plasmide pGEM-3Z dans la fenêtre prévue à cet effet. NB : la séquence sera copiée directement sur la page "Nucleotide" du NCBI.
- Préciser le type de carte que vous souhaitez obtenir (circulaire / linéaire)
- Sélectionner uniquement les enzymes à coupure unique.
- Enregistrer l'image de la carte plasmidique dans votre compte-rendu en réalisant une capture d'écran.
- A l'aide de la fiche au format "GenBank" du NCBI et du résultat de "Analyse Sequence" (onglet Map and Feautures), construire un tableau et :
- Relever la taille du plasmide
- Identifier la nature et la position du gène de sélection (relever les positions des premiers et et derniers nucléotides)
- Déterminer la signification du terme "complement" utilisé pour ce gène sur le rapport "GenBank"
- Relever la position du MCS
- Relever la position du gène lacZ . Comparer ici les résultats des 2 programmes.
Effectuer la même démarche sur "Analyse Sequence" avec la séquence de pGEM-luc, et penser à enregistrer l'image obtenue.
- Relever la taille du plasmide
- Retrouver la taille et la position du gène de la luciférase
A partir des deux cartes plasmidiques, identifier 2 enzymes permettant de faire un clonage directionnel
III - Calcul des tailles des fragments générés après coupure
Le logiciel NEBcutter permet d'établir des cartes de restriction et de calculer la taille des fragments générés après hydrolyse.
- Copier et coller la séquence de pGEM-3Z dans la fenêtre prévue à cet effet, et nommer la séquence. Analyser les paramètres par défaut. Un des paramètres doit être modifié pour adapter l'analyse à notre cas de figure. Lancer le programme.
On obtient une carte de restriction.
- Dans les options principales (Main options), selectionner "custom digest", puis sélectionner les enzymes choisies précédemment pour le sous-clonage directionnel.
- Lancer le programme.
- Demander une vue du gel, en incluant le marqueur 1Kb ladder.
- Noter la taille des fragments, et conserver une image du résultat (capture d'écran).
- Renouveler l'opération avec le plasmide pGEM-luc.
- Quelle sera la taille du plasmide recombinant?