​
II- Analyse des séquences

 

1.1- Analyse préliminaire

​A partir du document présentant la comparaison nucléotidique :

- Faire apparaître, en les surlignant, toutes les différences entre les deux séquences (« mismatches »)

A partir du document présentant la comparaison protéique :

- Sachant que la GFP est une protéine de 238 acides aminés, vérifier que l’intégralité de la séquence est présente sur l’alignement (nombre d’AA, codon START, codon STOP…)

- Faire apparaître, en les surlignant, toutes les différences entre les deux séquences

Conclure sur le type de mutations mises en évidence en comparant les deux alignements.

 

​
1.2- Recherche des mutations impliquées dans l’augmentation de la fluorescence de la protéine GFPuv

 

​

- Combien de mutations d’acides aminés semblent être impliquées dans l’augmentation de fluorescence ?
- Répertorier les mutations selon la nomenclature suivante :​​​​​​​​​

A56L (XY) : 167
Avec :  A : acide aminé d’origine (wt) en code une lettre

            L : acide aminé dans  la protéine mutée (en code à une lettre)
  56 : position de l’acide aminé dans la protéine (1=Methionine)
  X : nucléotide d’origine (wt)
  Y : nucléotide dans la séquence mutée (uv)
  167 : position du nucléotide muté (=56*3 +/- 2)

​

1.3- Analyse des autres mutations

​

Afin de poursuivre l’étude la protéine GFPuv, on peut se demander pourquoi la société Clontech a réalisé dans cette protéine mutée, d’autres mutations (……………………..) qui ne semblent pas impliquées dans l’augmentation de la fluorescence.

 

Deux hypothèses majeures peuvent être émises :

1- Ces mutations permettent de créer ou de supprimer des sites de restriction dans le gène
2- Ces mutations permettent une optimisation des codons

​​

1.3.1- Réalisation de cartes de restriction

​

Réaliser les cartes de restriction des deux séquences nucléotidiques et effectuer une comparaison, selon la méthode suivante :

A partir de l’application « RESTRICTION ANALYSER » développée par Molbio :

https://molbiotools.com/restrictionanalyzer.php

 

- Coller tour à tour  les deux séquences nucléotidiques (CDS GFP-wt et CDS GFP-uv) dans la fenêtre prévue à cet effet. (analyser d'abord la première séquence, puis recommencer avec la seconde)
- Dans le menu « restriction enzyme selection », cliquer sur "pre-selected commonly used enzymes".
- Lancer la recherche des sites.
- Faire une capture d'écran du tableau de résultats (ou copier-coller le tableau dans votre rapport)
- Recommencer avec la seconde séquence.
- Comparer les résultats.

- Combien de nouveaux sites sont apparus dans la séquence GFP-uv ?

-- Combien de sites ont disparu dans la séquence GFP-uv ?
- Localiser ces sites (associés aux mutations) sur l’alignement de séquences nucléotidiques (BLAST N : Query : GFPuv / Subject pGFP) en utilisant un code couleur spécifique.

​

1.3.2- Recherche d’une optimisation de codons



A partir du document : BLAST N : Query : GFPuv / Subject pGFP :
- Parmi les mutations qui restent et dont la fonction demeure inconnue, rechercher des motifs de trois nucléotides que l’on retrouve d’une mutation à l’autre.
- Ces motifs de trois nucléotides ou codons sont-ils dans la phase codante ?
- Si oui retrouver, pour la protéine sauvage, et pour la protéine mutée, l’acide aminé codé par ces différents codons.
- Conclure.

 

 

 

III- Synthèse



Faire apparaître sur le document BLAST N : Query : GFPuv / Subject pGFP , toutes les mutations, avec le code couleur suivant :
- Rouge : augmentation de la fluorescence
- Bleu : nouveaux sites (les nommer)

- Jaunes : sites disparus
- Vert : optimisation de codons
- Orange : Éventuelles mutations à rôle non déterminé