​Deuxième approche : réalisation d’une PCR utilisant les amorces universelles du vecteur pGEM 3Z.

1- Sur le site du NCBI, rechercher rechercher la séquence au format GenBank du plasmide pGEM 3Z.
2- Noter son numéro d’accession : X…………………

3- Enregistrer la séquence du plasmide AU FORMAT FASTA (dans un nouveau fichier) et au format brut (dans votre compte-rendu).
4- Repérer dans la séquence au format GenBank, le nom et la position des amorces universelles pour ce plasmide. Reporter ces informations dans votre compte-rendu.
5- Ecrire la séquence de ces deux primers (5’-3’).

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NB : Par convention :
- Le primer FORWARD (FWD - ou sens) à une séquence identique au brin codant (5’-3’)
- Le primer REVERSE (REV-  ou antisens) a une séquence complémentaire au brin codant​

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6- Positionner (à l’aide de flèches colorées) les primers sur la séquence d’ADN du vecteur au format brut en précisant leur nom et leur orientation (5’-3’).

7- Faire apparaître en couleur, sur cette même séquence, les sites de restriction SacI et BamHI, et souligner le fragment éliminé lors du clonage.
8- Calculer la taille de l’amplicon dans le cas d’un vecteur non recombinant.
9- En vous aidant du schéma en page 1, calculer la taille de l’amplicon dans le cas d’un vecteur recombinant sachant que l’insert luc a été cloné par les enzymes BamHI et SacI.
9- En utilisant Primer3, retrouver la taille de l’amplicon non recombinant et la température d’hybridation des deux amorces. Copier et coller le résultat dans votre compte-rendu.

 

Attention, la séquence d’ADN fournie ici est linéaire. Or le plasmide est circulaire. Il convient donc de donner une séquence appropriée pour que le programme puisse simuler une PCR.

10- Les paramètres indiqués par Primer3 sont-ils satisfaisants ?
11- Dégager le ou les intérêts de la seconde approche (utilisant les amorces universelles) par rapport à la première ?

 

 

 

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